พันธุวิศวกรรมและการวิเคราะห์ DNA

พันธุวิศวกรรม (Genetic engineering) คือ การใช้เครื่องมือทางชีวภาพเพื่อตัดต่อดีเอ็นเอ ให้มีคุณสมบัติตามความต้องการ โดยอาศัยการทำงานของเอนไซม์ 2 กลุ่มหลัก

1. Restriction enzymes เอนไซม์ตัดจำเพาะ ที่สามารถ ตัดสาย DNA  รหัสเบสที่จำเพาะเจาะจง เช่น ECORI ตัดจำเพาะที่ 5’...GATCC….3’ Restriction enzyme บางชนิดเมื่อตัดแล้วจะทำให้ DNA มีปลายเปิด 1 สายเรียกว่า sticky end ส่วนเอนไซม์บางชนิดเมื่อตัดแล้วจะทำให้ DNA ไม่มีปลายเปิด เรียกว่า blunt end
2. DNA ligase เอนไซม์ที่เชื่อมสาย DNA เข้าด้วยกันโดยการสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ (phosphodiester bond) โดย sticky end จะเชื่อมง่ายกว่าและมีประสิทธิภาพมากกว่าการเชื่อม blunt end DNA
   
   

เมื่อมีการตัดและเชื่อม DNA ชนิดใหม่เข้าไปจะเรียกว่า Recombinant DNA

เทคโนโลยีการเพิ่มจำนวน  DNA หรือ Gene cloning

มีการตัดต่อพันธุกรรมได้ตามที่ต้องการแล้ว (recombinant DNA) ต้องมีการเพิ่มปริมาณ DNA เพื่อนำไปศึกษาต่อ ซึ่งโดยทั่วไปสามารถทำได้ 2 วิธี

1. Gene cloning by bacterial plasmid

วิธีนี้เพิ่มปริมาณ DNA การเพิ่มจำนวน หรือการแบ่งตัวแบคทีเรียจะได้ DNA ที่ตัดต่อตามความต้องการแล้ว มาตัดต่อใส่ลงในพลาสมิด โดยพลาสมิดนี้มักจะมียีนที่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะ (antibiotic resistant gene) สำหรับแบคทีเรียที่รับเอา พลาสมิดดังกล่าว จะสามารถเจริญเติบโตได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผสมยาปฏิชีวนะชนิดนั้น ๆ ส่วนแบคทีเรียที่ไม่ได้รับเอาพลาสมิดดังกล่าวก็จะตายไป จากนั้นเราสามารถสกัด plasmid DNA และ recombinant DNA จากแบคทีเรียที่รอดชีวิต

ตัวอย่างรายละเอียดการทำยีนโคลนนิ่ง

1. Recombinant DNA fragments และ plasmid DNA จะถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
2. Enzyme ligases เชื่อมปลายของ recombinant DNA fragment เข้ากับปลายเปิดของ plasmid DNA ได้เป็น recombinant plasmid
3. แบคทีเรียบางส่วนรับ recombinant plasmid เข้าไปในเซลล์ บางส่วนไม่ได้รับ
4. เลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบไปด้วยยาปฏิชีวนะ ชนิดเดียวกับที่พลาสมิดมียีนดื้อยา
5. แบคทีเรียจะสามารถเจริญเติบโตเป็นจำนวนมากกว่าชนิดที่ไม่ได้รับพลาสมิด และถูกเก็บเกี่ยวเพื่อนำไปสกัด plasmid DNA

2. PCR cloning (Polymerase Chain Reactions)

เทคนิคการเพิ่มจำนวน DNA โดยอาศัยปฏิกิริยาห่วงโซ่ของเอนไซม์ polymerase เป็นเทคนิคที่อาศัยหลักการเลียนแบบการคัดลอก DNA  (DNA replication) ในสิ่งมีชีวิต โดยไม่ใช้สิ่งมีชีวิตใด ๆ

1. เทคนิคนี้ใช้เครื่อง thermocycler ซึ่งสามารถตั้งเวลา และตั้งอุณหภูมิเป็นรอบ ๆ อัตโนมัติให้ซ้ำได้ตามจำนวนรอบที่ต้องการ
2. การเพิ่มจำนวน DNA ด้วยเทคนิคนี้สามารถทำได้ในหลอดทดลอง ไม่อาศัยสิ่งมีชีวิตใด ๆ และต้องการ DNA ตั้งต้นจำนวนเล็กน้อยเท่านั้น เช่น DNA จากคราบเลือดหรือโคนผม
   
   

ส่วนประกอบที่ใช้ในการทำ PCR ได้แก่

1. Chemical buffers ที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา PCR
2. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด dNTPs
3. Enzyme polymerase นิยมใช้กับที่สามารถทนความร้อนได้
4. DNA สายต้นแบบที่ต้องการเพิ่มจำนวน
   (template DNA)
5. DNA primers เป็นลำดับเบส 20 ถึง 40 นิวคลีโอไทด์เป็นเบสคู่สมกับ DNA สายต้นแบบเพื่อเป็นจุดเริ่มต้นในการคัดลอก  DNA

ขั้นตอนหลักในการคัดลอก DNA ในเครื่อง thermocycler

1. Denaturation คือการใช้อุณหภูมิสูงที่ 90 - 95 °C ในการสลายพันธะไฮโดรเจน ทำให้สาย DNA แยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว 2 สาย (single strand DNA)
2. Annealing การลดอุณหภูมิมาที่ 35 - 60°C เพื่อให้ DNA primer จับกับ DNA สายต้นแบบ
3. Polymerization การคัดลอก DNA โดยเอนไซม์ polymerase ที่อุณหภูมิ 60 - 70°C
4. Repeat ทำขั้นตอน 1 - 3 วนไป 30 ถึง 40 รอบเพื่อให้ได้ปริมาณ DNA มากพอเพื่อวิเคราะห์และศึกษาต่อ
   
   

เปรียบเทียบข้อแตกต่าง

การโคลนด้วยเทคนิค PCR
และเทคนิค Bacterial cloning

• การใช้เจล (Gel electrophoresis) เทคนิคนี้เมื่อ DNA ถูกเพิ่มจำนวนในลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะ ทำให้ DNA มีขนาดความสั้นยาวแตกต่างกันไปตามการออกแบบไพรเมอร์ จึงทำให้ชิ้นส่วน DNA ที่ถูกเพิ่มจำนวนนี้มีขนาดประจุและรูปร่างต่างกันในสนามไฟฟ้า เมื่อใช้กระแสไฟฟ้าภาคโมเลกุลดีเอ็นเอผ่านตัวกลางที่เป็นวุ้น จะได้ผลที่เป็นลายพิมพ์ DNA โดยชิ้นส่วน DNA จะมีประจุรวมเป็นประจุลบ DNA จึงเคลื่อนที่จากประจุลบเข้าหาประจุบวก ชิ้นส่วน DNA ชิ้นใหญ่จะเคลื่อนที่ช้าที่สุด และติดอยู่ด้านบน ส่วน DNA ชิ้นเล็กจึงเคลื่อนที่ได้เร็วและอยู่ใกล้ประจุบวกมากกว่า วุ้นที่เป็นตัวการให้ DNA เคลื่อนผ่านนิยมใช้ agarose หรือ polyacrylamide การที่จะสามารถถ่ายภาพ DNA ได้ ต้องใส่สารย้อมจำเพาะ เช่น ethidium bromide ซึ่งสามารถจัดกับส่วน Major Grooves ของ DNA และเรืองแสงภายใต้แสง Ultra Violet (UV)